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      常規切片的注意事項

        1 . 取材

        取材的好壞,直接影響切片的質量。醫生在取材時,首先要有一把鋒利的取材刀,在切割組織時要避免取材刀來回拖拉,切取的組織塊厚薄要均勻,一般厚度以0.2 ~0.3cm 為適,較容易發脆的組織如甲狀腺、肝臟、血塊、淋巴結、大塊癌組織等可適當厚一點,而脂肪組織、肺組織、纖維性腫瘤、平滑肌瘤等致密的或試劑不易滲入的組織應取薄一些;淋巴結應修掉兩側球冠,并盡量剔除周圍的脂肪組織。在取材中還應十分注意組織內是否有縫線或骨組織,如碰到不可避免的鈣化組織,應與技術室講明,在切取纖維組織、肌肉組織、胃腸道時,應注意纖維及肌肉的走向,取材時盡可能按與纖維平行走向切取為佳。

        2 . 固定

        固定是技術室工作的第一步,也是在整個制片過程中無法補救的一步。所謂“固定”,就是組織離體后,用各種辦法使其細胞內的物質盡量接近其生活狀態時的形態結構和位置的過程。固定的目的是為了防止組織細胞自溶與腐敗,防止了細胞內的酶對蛋白質的分解作用,使細胞內的各種成分如蛋白質、脂肪、碳水化合物或酶類轉變為不溶性物質,以保持原有的結構與生活時相仿。另外,組織固定后,均呈一定的硬化狀態,增加組織韌性,而且不易變形,有利于以后的組織處理。所以組織一旦離體必需及時固定,固定液的量應為組織的5 倍。固定的關鍵主要與固定的及時性、固定液的選擇、固定液的濃度、固定的溫度和時間有關。最常用的固定液為10%福爾馬林。筆者認為,10%福爾馬林由于受到福爾馬林的質量、使用時的揮發和取材時帶入的水分影響,濃度被降低致組織固定不足,而高濃度的福爾馬林,降低了對組織的穿透性,形成周圍固定好而中央固定不到的現象。通過實踐,本人認為以酸性12~15%的福爾馬林最佳。大標本(2cm 厚)一般需要6~12個小時,小標本一般需要3~6 個小時;當室溫低18℃時,可在37℃以下的溫箱內加溫4~6 個小時。由于HE 染色最佳著色PH為3.5~4.5, 中性福爾馬林對蘇木素染色有一定影響,細胞核容易發灰,核染色質不佳。

        所以, 盡管中性福爾馬林對抗原有很好的保存作用,但酸性福爾馬林對絕大多數抗原來說也有很好的保存作用,所以在沒有特別處理的情況下常規HE 用12~15%酸性福爾馬林也可以(每100毫升

        12~15%福爾馬林液內加5毫升冰醋酸)。骨髓、結締組織固定以Bouin 液為佳,經Bouin 液固定后的組織必須流水沖洗4 小時以上。有條件的單位可根據不同要求選用二種或二種以上的固定液;少數單位還可建立組織冷凍庫,以便適應各種特殊的處理要求。

        3. 水洗

        固定后水洗(10~20 分鐘),通常被很多人所忽視,而水洗不徹底,容易造成脫片和染色不鮮艷。對需做免疫組織化學的組織,更不應當忽視。福爾馬林不利于組織塊內抗原的保存。

        4 . 脫水和透明

        所謂脫水就是利用脫水劑將組織內的水分置換出來,以利于有機溶劑的滲入,這一過程稱為脫水。

        脫水是否徹底,直接關系到組織是否能充分透明,而脫水過度(原因是組織在純酒精內時間過久,發生組織質地發生變化)容易造成組織發脆。造成組織發脆的原因還有加溫(溫度超過 35℃)、脫水劑內加有丙酮、浸蠟用的石蠟中二甲苯過多等等。一般我們總認為組織發脆跟高濃度酒精有關,而忽視了與低濃度的酒精關系,其實低濃度的酒精具有強大的穿透力,比純酒精更容易滲透到組織塊內部使之脫水,組織如果在低濃度酒精里充分脫水,在高濃度酒精里只需脫去從低濃度到高濃度之間的水份,因此,僅需短時間就可完成,如果這時不縮短純酒精的時間,便會引起組織發脆;如果脫水時加溫,使用丙酮,還可引起組織收縮,并影響免疫組織化學的標記。為了使石蠟浸入到組織塊內,必須經過一種既能與脫水劑混合,又能與石蠟相溶的媒介物質,這個過程稱透明。目前最好的透明劑是二甲苯。

        很多人認為二甲苯極容易使組織發脆,這個觀點很片面,在常溫下,如果不是時間過長(超過24 小時以上)二甲苯并不會引起組織過份發脆,相反會使某些組織結構比較質韌的組織:比如子宮肌瘤等相當好切),但是當二甲苯溫度超過 35℃以后,極易引起組織發脆。所以本人認為,大小標本最好分開脫水,一般情況下,大標本脫水時間(室溫18℃)以80%酒精2 小時、95%酒精(2道)各1個半小時至2 小時、純酒精(3道)各1個半小時至2 小時,二甲苯(2道)各30-60 分鐘為宜;小標本脫水時間應相應縮短。脫水時間長短,與室溫高低有密切的相關。我們在實踐中發現,室溫在12~15℃時,可作為一個臨界溫度范圍。當室溫高于此溫度范圍時,組織容易脫水,可適當縮短脫水時間;而室溫低于該溫度范圍時,應適當延長脫水時間(如能保證在一個恒定的溫度下最佳)。更換試劑,應以量為基礎,定量更換,不能等到切片不好時再去更換。否則,至少會有2~3批組織切片不好。根據我科經驗,如試劑用量為500ml,每500個蠟塊更換一次為宜。

        5. 浸蠟

        組織透明后,在熔化的石蠟內浸漬的過程稱為浸蠟。用其他浸透劑(如火棉膠、明膠等)滲入組織內部的過程可稱為浸透或透入。浸蠟溫度過高(超過 60℃),在蠟內加入二甲苯蠟或由于透明時帶進的二甲苯過多,都會導致組織發硬,還會使組織內的抗原受到破壞;所以作者主張浸蠟用的石蠟熔點在56℃(三道),第一道:石蠟30 分鐘;第二道:石蠟90 分鐘;第三道:石蠟,90 分鐘。浸蠟溫度控制在56~58℃左右。(第一道也可用硬脂酸石蠟1:3混合浸蠟,不僅可軟化組織,特別適用于比較韌、硬的組織,而且由于硬脂酸是弱酸性的,對細胞核有媒染作用,核漿比鮮明,但容易脫片;同時對疏松組織容易散片)。有條件的可以每天打開第一道石蠟的蓋子,讓二甲苯揮發。浸蠟所用的石蠟如有雜質盡可能過濾,以防附在組織上,造成切片刀刀口受損,或切片破碎和劃痕增多。

        6. 包埋

        用包埋劑來支持組織的過程稱包埋。最常用的是石蠟包埋法。包埋的關鍵一是平整,二是方位。要求在包埋時,應采用鑷子輕壓組織塊拱起部份,使之平貼于底部,通常采用組織的最大面包埋。囊壁、管腔組織應豎直包埋。小塊多顆組織,應盡量放在一起,并保證在一個平面上。修去兩邊的余蠟(所謂的兩邊,指切片時與切片刀垂直的兩側)。包埋時還應注意有無縫線,紙絮,如有一定要去除。

        胃黏膜活檢標本,不能按一般的規律取最大包埋面,應采取窄面豎起包埋。包埋的蠟更應過濾,留有雜質的石蠟,容易造成污染或刀口受損。蠟的熔點應在56~58℃之間選擇,不提倡在冬天使用軟蠟。

        因為用軟蠟包埋的蠟塊,到了夏天,會粘在一起,不利于資料的保存,而且即使在冬天,用硬蠟包埋的蠟塊也比用軟蠟包埋的蠟塊要好切。

        7. 磨刀

        要想切好一張切片,首先要有一把鋒利的切片刀。磨刀是從事切片技術人員的一項最基本技術,刀磨的好壞,直接關系到切片的質量。磨刀的手法各人不同,但都要求用力均勻,使刀口和磨刀石全面接觸,兩手的用力點應在刀口上,而不是在刀背上。切片刀應用一次磨一次,每次僅需10~15分鐘,過長時間的磨刀,容易把已經磨出的鋒刃磨掉,檢查切片刀是否鋒利,用手試摸刀口的方法并不十分科學,不僅不能證明切片刀是否真正鋒利,而且容易損害刀口,最簡單的辦法是每次磨好后拿一個蠟塊試切一下。每次磨好刀后,應將磨刀石用蓋子蓋好,以防灰塵掉在磨刀石上,用有灰的磨刀石磨刀,會使切片刀產生許多細小的缺口?,F在很多單位都買了磨刀機,磨刀機用來開刀鋒和磨缺口的確不錯,但由于磨刀的角度和時間不易精確掌握,故效果并不理想。根據我們的經驗,真正的鋒刃很難用機器磨出來。一次性刀片在很大程度上解決了這個問題。如用一次性刀片,必須及時更換刀口。一個刀口切小標本不應超過20~25 只蠟塊,切大標本不應超過10~15只蠟塊。

        8. 切片

        切片的第一步必需粗切。粗切的厚度大約在50~100微米左右,質地較硬的組織或較小的組織應再薄一些,粗切致組織全部暴露后,才進行細切。細切至組織塊表面均勻一致,無白點后,再把切的蠟片放入溫水中。切片時要求用力均勻、柔和,搖速不易過快或過慢。過快會導致切片厚薄不均,機器磨損;過慢會使切片增厚。切片厚度一般為3~5微米。切片的要求是完整、薄、均勻。切下的片膜其大小形狀應與組織塊一致,切片的不完整,常會將重要病變遺漏,導致誤診、漏診。在切片放蠟塊時,應注意組織包埋的方向,組織的層次,纖維、肌肉等的走向應與切片刀平行,較難切的部分應放在上面,如皮膚的表皮,腫塊的包膜,胃腸道的漿膜等,這樣可以減少組織的斷裂現象。操作切片機時應用力均勻,避免用力過重。對脫鈣組織、骨髓,以及已知的鈣化組織,應選用固定的刀口,以減少其他部位出現缺口的可能性。在使用毛筆展片時要防止筆絲進入刀口,因為每切到一根筆絲,就會增加一個缺口。切片厚度一般為4~6微米,有人認為:只要切片機刻度標著幾個微米,切出來的片子就是幾個微米。其實不然,當切片刀不鋒利,或切片時速度不勻,或切的較慢時,切的片子都會變厚,只有在切片刀十分鋒利、切片勻速的情況下,才能真正保證其厚度。

        下面是切片時碰到的問題的原因

        及可能處理的方法:

        (1)組織發脆:一般是脫水、透明、浸蠟時間過長、溫度過高,并與組織本身質地也有關,在切片時,邊切邊用嘴向蠟片吹氣,可能會好些。

        (2)切片卷起,可能是刀不鋒利,或刀鋒在另一面,或刀角度過大,切片太厚等等。

        (3)蠟片彎曲:可能是刀鋒不均,切片刀未磨直,切片刀與蠟塊不平行。

        (4) 透明、浸蠟時間過長、溫度過高,并與組織本身質地也有關

        (5)厚薄不均:可能是刀、刀座及蠟塊未夾緊,組織太硬,或切片機主軸太向前,或切片機已磨損。

        (6)切片出現裂痕:可能是刀有缺口,石蠟內有雜質,組織內有鈣化、骨片或有線結, 也可能會有棉紙纖維等。

        (7)切片不連片,切不下片,切片很厚,或者切片后蠟塊發白,內陷:組織脫水不佳。補救辦法:可先將蠟塊溶解,取出組織,放入加熱水浴的丙酮內(80℃),30~60 分鐘,再進行透明浸蠟包埋切片,也許會好一點。

        9. 展片與撈片

        展片水溫應在42℃至47℃之間,這主要和包埋蠟的熔點有關,水溫過高,會引起組織細胞散開,水溫過低,切片皺摺無法攤平。包埋蠟中如有二甲苯,也會造成石蠟溶解現象。而用一次性刀片切的片子,一碰到熱水,片子上的皺摺就無法再展開,這有二個方法可以解決:第一、可以在切片時邊切邊向蠟片吹氣,這樣的片子就會非常平整,放到熱水里就會自然展開,比較方便快捷,但這樣的片子會略微厚一點;第二、在切完片子后,先把切片放在 30%酒精水溶液中,讓酒精的張力自動把皺摺展開,然后再將切片移到熱水,這樣的片子會較薄;如酒精濃度過高,容易引起切片破碎,出現裂隙,像脂肪之類細胞間粘附性較小的組織一碰到酒精就會散開,故不能用此法。最后撈片時玻片要干凈,要選擇那些完整、無皺摺的切片,粘貼于玻片中1/3和下1/3 的中間。

        10. 烤片和脫蠟

        烤片,一般在60℃的溫箱內烤片0.5~1小時左右,溫度過高,會引起切片細胞收縮;時間太短(少于20 分鐘),容易造成脫片。脫蠟也相當重要,如果脫蠟不干凈,切片不易著色或著色不勻,所以,脫蠟用的二甲苯要經常更換,一般用3道二甲苯,每500ml 液體,處理500 張切片后更換一次為宜。

        當室溫低于18℃時,必須將切片從溫箱拿出后立即放入二甲苯中脫蠟,或將二甲苯放入溫箱內預熱(37℃左右)脫蠟,最高不得超過60℃。然后經高濃度的酒精到低濃度的酒精洗去二甲苯,至水。

        11. 染色

        蘇木素染色時間要根據染料的新舊、溫度、切片的類型而定,一般為5-15分鐘。經水略洗后,用鹽酸酒精分化,分化程度必須用顯微鏡控制。分化水洗后,可用溫水或自來水藍化,并充分水洗 (流水沖洗5分鐘以上),以防鹽酸殘留導致切片褪色。我們不提倡使用堿性溶液(釋氨水、肥皂水等)促藍,盡管藍化效果很好,但從實踐的結果來看,用堿性溶液促藍的切片不能長期保存,容易褪色。最后入伊紅復染(5-20秒)。HE 染色的關鍵在于深淺適度,對比鮮明,一般有經驗的,肉眼就能判斷,但偶而也會出現失誤,所以用顯微鏡控制是最保險的方法。其關鍵的步驟在于蘇木素染好后的分化及藍化過程,在藍化結束后,應在顯微鏡下觀察細胞核著色是否合適,核結構是否清晰,胞漿內是否有殘留的蘇木素等等。染色理想的切片在顯微鏡下應是:細胞核與細胞漿應藍紅相映,鮮艷美麗;核漿對比明顯,核膜及核染色質顆粒清晰可見。

        12. 脫水和封片

        切片脫水應從低濃度的酒精到高濃度的酒精,80%酒精1 道,95%酒精2 道,純酒精2 道,(正丁醇1 道),二甲苯2道。濃度低的酒精比濃度高的酒精更容易脫水,但也容易使伊紅退色,故脫水時間可短一點,每道3-5 分鐘,純酒精每道10分鐘。為增加酒精與二甲苯的相融性,可在二甲苯前面增加一 道正丁醇;石碳酸-二甲苯液也有此效,但用石碳酸時如不洗凈,可引起切片退色,不利于切片久存, 故不作推薦。切片經二甲苯透明后,用中性樹膠封固。為增加切片的透明度,防止細胞收縮、龜裂或 切片出現黑色結晶樣小點。所以我們規定切片必須濕封,不得用溫箱烤干或電吹風吹干后干燥封片。

        在南方冬春、霉雨季節,封片時要防止口鼻呼出的氣體接觸到切片;在天氣較潮濕的日子里,不宜一 次將多張切片取出待封,以免切片“還潮”,形成透明不佳,出現云霧狀水珠。脫水劑的更換也應有一 定的時間規定。一般是每500ml 液體,處理500 張切片后更換一次為宜。封片樹膠不能過稀,封片時樹膠要均勻充滿蓋玻片且樹膠不及外溢為佳。要將組織全部覆蓋,也不能有氣泡。最后,粘貼標簽,標簽必須貼于玻片左側,編號書寫清楚,最好能打印。